蝎毒对癫痫大鼠海马内强啡肽原mRNA表达的影响

　　已报告癫痫大鼠强啡肽原(Prodynorphin,PDYN) mRNA长期持续低表达^［1，2］， 提示癫痫发作的敏感性的形成可能与PDYN mRNA表达水平的长期持续性降低有关。我们新近 的工作证实蝎毒具有明显的抗癫痫反复发作的作用，能抑制一次急性癫痫发作后海马内星形 胶质细胞的增生，减轻神经元受损的程度^［3］。但有关蝎毒抗癫痫反复发作的阿片 肽机制迄今尚未见报告。本工作用红藻氨酸(kainic acid，KA)癫痫模型报道东亚钳蝎(Buth us Martensii Karsch，BMK)粗毒增加癫痫大鼠海马内PDYN mRNA表达的原位杂交观察结果， 旨在分子水平上探讨蝎毒抗癫痫作用的可能的阿片肽机制。

　　1　材料与方法

　　1．1　实验分组和脑片制备

　　选用健康雄性SD大鼠(体重180～220g)，自由进食饮水，自然昼夜。一次性颈部皮下注 射惊厥剂量的红藻氨酸(10 mg/kg)，诱发大鼠出现急性癫痫发作。癫痫发作行为的严重程度 按Racine所描述的1～5级标准进行观察记录。选用癫痫发作级别在4级以上的大鼠16只随机 均分成两组，即实验给药组(KA+SV)和实验对照组(KA+NS)。分别用2 ml BMK蝎毒(SV，0．04 %)和相同体积的生理盐水(NS)灌胃，每日一次，连续三周。另选用12只大鼠随机分成两组， 颈部皮下注射生理盐水(0．2 ml／100g)后，用相同剂量的蝎毒或生理盐水灌胃做为空白给 药组(NS+SV)和空白对照组(NS+NS)。三周后用4％水合氯醛(400 mg/kg，i.p)麻醉；依次用0 ．01 mol/L PBS，4％多聚甲醛+1．25％戊二醛／0．01 mol/L PBS经心脏灌流；取脑； 4％ 多聚甲醛后固定；再置入含15％蔗糖的磷酸盐缓冲液中。用XY-86型振动切片机切取20 μm 厚海马冠状脑片。

　　1．2　原位杂交实验

　　1．2．1　探针标记　用与大鼠强啡肽原有互补序列的33mer的寡核苷酸直接 与信号酶(碱性磷酸酶)相联接。

　　1．2．2　杂交　各组动物的海马脑片在杂交液(杂交缓冲液＋探针，26 ng 探针／ml杂交缓冲液)42℃下孵育过夜，用2xSSC于42℃下漂洗15 min；用1xSSC室温下漂洗 脑片10 min x 2。

　　1．2．3　免疫检测　分别用缓冲液I(mol/L) Tris-HCl 0.1、NaCl 0.15、p H7．5)和缓冲液Ⅱ(mol/L)Tris-HCl 0.1、NaCl 0.1、MgCl₂0.25、pH 9．5)室温下振动 漂洗脑片2 min，用显色剂(NBT＋X-磷酸盐)显色，甘油明胶封片，光镜下观察并摄片。

　　1．3　形态学的图像分析扫描

　　用LEICA Q500MC图像分析仪(德国)进行海马脑片细胞计数。选实验对照组、实验给药 组、空白对照组和空白给药组大鼠各6只，每个动物测3张脑片。脑片的选定部位按George P axinos ＆ Charles Watson的大鼠脑图谱确定^［4］，前囟后5．80 mm即海马结构所 在部位。先在10×物镜下观察脑片，选取腹侧海马门部位；然后在荧光屏上画出测量框的轮 廓，测量框面积为61557 μm^［2］，宽度(W)和高度(H)分别为213　μm、289　μm ，计算测量框内PDYN　mRNA阳性神经元的个数。每个动物的3张脑片数值相加后取平均值。

　　1．4　统计学处理

　　实验数据用均数±标准误(±S)表示，并输入计算机进行统 计学处理。四组先进行方差分析，求得F值，然后每两组之间再用q检验进行比较。

　　2　结果

　　2．1　海马部位原位杂交检测PDYN mRNA阳性神经元的变化

　　原位杂交的检测结果显示，空白对照组(NS＋NS)大鼠的PDYN mRNA阳性神经元散在分布 于腹侧海马门区(图1，1C)。与NS＋NS组相比，KA后三周实验对照组(KA＋NS)大鼠的腹侧海 马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显减少，几乎完全消失(图1，1A)(表1，P＜0．01 )。实验给药组(KA＋SV)大鼠(图1，1B)，8例中有的6例腹侧海马门区PDYN mRNA阳性神经元 数目不仅未见减少而且明显增加，高于KA＋NS组(表1，P＜0．01)和NS＋NS组(表1， P＜0．01)，与NS＋SV组相比无显著差异(表1，P＜0．05)。

　　空白给药组(NS+SV)大鼠，与NS+NS组相比，腹侧海马齿状回PDYN mRNA阳性神经元数目 明显增加，以海马门区密度最高，呈均匀分布(图1，1D)(表1，P＜0．01)。各组大鼠背 侧海马PDYN mRNA表达的变化与腹侧海马相似。

　　结果表明KA后三周，腹侧海马门部位表达PDYN mRNA的中间神经元明显脱失。BMK蝎毒能 选择性防止其脱失，并使PDYN mRNA的表达增加；同时也使空白给药组大鼠腹侧海马门部位PDYN mRNA的表达增加。

　　fig．1 PDYN mRNA positive neuro ns in the ventral hippocampus of epileptic rats treated with scorpion venom for three weeks(A.B.C.D NBT staining,×50)3　讨论

　　强啡肽(dynorphin，DYN)是中枢神经系统内的一个重要阿片肽，它在调节脑的兴奋性尤 其是癫痫相关脑区一海马结构的兴奋性方面起重要作用。己证实强啡肽在边缘系统各部分高 表达，尤其是在海马的齿状回^［5］；强啡肽能激活kappa型阿片受体，通过多突触机 制抑制穿通通路和苔状纤维内兴奋性氨基酸的释放，具有明显的抗惊厥作用，是内源性阿片 肽^［6，7］。

　　Tab．1 Quantitative analysis of PDYN mRNA pos itive neurons in the ventral hippocampus of epileptic rats treated with scorpion venom for three weeks (±s）

　　^*　*　P＜0.01, vs NS+NS group;　^##　P＜0.01, vs KA+NS group

　　己报告癫痫大鼠PDYN mRNA长期持续低表达^［1，2］；我们新近的工作证实蝎毒 具有明显的抗癫痫反复发作(epileptic seizure)的作用^［3］，但有关蝎毒对癫痫大 鼠海马内PDYN mRNA的表达的影响迄今尚未见报告。本工作发现KA后三周，癫痫大鼠腹侧海 马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显减少，表明癫痫发作后腹侧海马门区PDYN mRNA的表达 水平明显降低，这与前人的报告相一致。但我们还进一步观察到BMK蝎毒能选择性地增加正 常大鼠腹侧海马门区PDYN mRNA的表达，提示蝎毒能加强生理性抗癫痫作用；癫痫大鼠经BM K蝎毒处置后，腹侧海马门区PDYN mRNA阳性神经元数目明显增加，表明蝎毒能翻转(reverse )腹侧海马门区PDYN mRNA的表达水平，选择性地增强海马门区DYN能抑制性中间神经元的 功能。推测这很可能是其抗癫痫反复发作的重要的细胞分子机制之一。

　　有报告用反义核酸技术封阻癫痫大鼠c-fos mRNA，降低Fos的水平后，PDYN mRNA的 表达降低60％；进一步的研究表明Fos作用于PDYN基因的AP-1位点，调节海马内的PDYN mRNA的表达^［1］。我们的实验也证实蝎毒能提高癫痫大鼠腹侧海马门区的Fos蛋白的 水平(待发表资料)。据此，我们推断BMK蝎毒增加腹侧海马门区PDYN mRNA的表达，可能是通 过提高Fos蛋白的水平来实现的。至于其详尽的作用途径还有待于进一步的研究。