蝎毒治疗癫痫研究

癫痫(epilepsy)是大脑神经元突发性异常放电,导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病,具有反复性和发作性的特征.所谓反复性,是指有了第一次之后,间隔一段时间之后肯定会有第二次、第三次以至多次发作.所谓发作性,是指症状突然出现,也突然中止.人们平时偶尔发生抽搐不能确定为癫痫,只有当病征满足上述两条特点时,才能确诊为癫痫病.

1 癫痫的发病机制

正常情况下,大脑神经元都有节律性的自发放电活动,但是频率较低.而在癫痫病灶的周围部分,其神经元的膜电位与正常神经元不同,在每次动作电位发生之后出现阵发性去极化偏移,并产生高幅高频的棘波放电.异常的高频重复放电使其轴突所直接联系的神经元产生比较大的兴奋型突触后电位,从而发生连续传播.这种异常电位波及到患者大脑的不同区域,受累及的区域出现功能障碍,从而使癫痫患者出现强直-阵挛(大发作)或者失神(小发作)等不同症状.癫痫是大脑内部神经元兴奋过程的增强和抑制过程的减弱,癫痫的发作需要神经元内诸多分子的参与.研究发现:癫痫患者的脑脊液内兴奋性神经递质谷氨酸的含量增高,而抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的含量降低;癫痫患者的脑脊液和脑组织中表现出免疫细胞因子TNF (肿瘤坏死因子)-α 和白细胞介素-6 含量增高、外周血中的抗脑抗体增高等特征;癫痫发作时,大脑海马和皮质中可抑制癫痫发作的一种内分泌激素糖皮质激素受体减少.研究还同时发现:白细胞介素-2、雌激素受体、代谢型谷氨酸受体等免疫、内分泌、神经物质都可共存于神经细胞.免疫细胞因子可通过受体和信使干预神经细胞内的转导过程而参与癫痫发病机制;内分泌激素通过其胞浆或核受体对神经细胞进行转录干扰,影响基因表达, 进而控制蛋白质合成而参与癫痫发病机制,内分泌激素也可通过对免疫功能的调节参与癫痫发病机制.慢性癫痫患者脑组织内除了有上述改变外, 还出现星形胶质细胞大量增生并呈Glu 免疫反应阳性,说明星形胶质细胞对谷氨酸的摄取和代谢发生了变化.在发病早期,星形胶质细胞对谷氨酸的摄取增高,这时该细胞内的兴奋性氨基酸转运体(EAAT)明显增加,它有缓和癫痫发作的作用.但是反复的发作可以使这种调节机制发生紊乱,星形胶质细胞将成为神经元异常放电与损害的重要促进机制,成为癫痫再发的原因.

2 蝎毒治疗癫痫的相关研究

研究蝎毒治疗癫痫之前必须先获得癫痫模型,常用的方法是用红藻酸(Kainic acid,KA)作用于模型组大鼠,再与正常对照组比较.分别采用高效液相色谱分析的方法测定两组大鼠额叶皮层、杏仁核和海马中神经递质Glu 的含量.结果显示癫痫模型组大鼠上述脑区的Glu 的含量均明显高于正常对照组(P<0.01).KA 癫痫大鼠模型的建立与神经递质Glu密切相关.

全蝎的主要活性成分为蝎毒(Buthotoxin),是一种类似蛇毒神经毒的多肽物质,也是全蝎抗癫痫的主要有效部分.人们采用Shim-Pack WCX-1 型阳离子交换高压色谱柱对中国东亚钳蝎全蝎毒进行了分离,先后提取出了诸如抗癫痫活性的多肽(AEP),镇痛活性多肽如蝎毒素-Ⅲ,透明质酸酶等物质.在鉴定了其中的抗癫痫肽、镇痛肽和抗肿瘤肽活性峰的基础上, 应用Shim-Pack DIOL-300 型凝胶排阻高压色谱柱对它们进行了进一步分离和鉴定, 可以得到较纯的3 种多肽.在高压色谱所提供的全蝎毒分离信息的基础上,应用与Shim-Pack WCX-1 色谱柱具有相同交换基团的、具有较大吸附容量的CM Sepharose CL-6B 软胶介质在低压色谱上对全蝎毒进行了分离,并对其中的抗癫痫肽进行了鉴定.如今已证实抗癫痫活性多肽(AEP)具有良好的抗癫痫作用.为了获得更好更纯的AEP,人们利用基因工程方法表达抗癫痫肽(AEP)串联体蛋白,并进行纯化、鉴定.先用PCR 扩增AEP 及AEp-His 基因片段,并分别克隆至测序载体中.测序正确后,用基因重组技术获得二串体基因,构建毕赤酵母表达载体pPIC9K-AEP2-His,甲醇诱导AEP2-His 在毕赤酵母中表达,用Ni-chelating Sepharose FF 柱纯化表达的融合蛋白, 并用抗His 单克隆抗体进行Western blot 鉴定.结果表明,构建了AEP 二串体酵母表达载体,获得了纯化的AEP2-His 蛋白,其相对分子质量约20 000.其他提纯蝎毒抗癫痫多肽的方法还有如抗癫痫肽/GST 融合表达及包涵体蛋白复性纯化等.

3 蝎毒治疗癫痫的作用机制

3.1 对神经递质及其受体的调节①蝎毒能减少GABA 能中间神经元的损伤,并使GABA 释放量增加.东亚钳蝎提取物可提高大脑皮层GABA 受体的集合活性和降低大脑皮层NMDA 受体的结合活性.GABA 的增加可以使神经元兴奋性癫痫发病和蝎毒治疗癫痫机制的研究进展有效地降低,从而起到抑制癫痫发作的作用.

②通过KA 癫痫大鼠经蝎毒处置3 周后,与实验对照组相比,蝎毒治疗后可防止KA 癫痫大鼠脑内前深梨状皮层T 区κ 阿片受体与NR2B 免疫反应反应阳性细胞数下降,对癫痫的敏感性降低.

③蝎毒还能选择性地增加癫痫敏感大鼠海马强啡肽原mRNA(PDYN mRNA)、胆囊收缩素原mRNA(PCCK mRNA)表达,提示蝎毒能加强生理性抗癫痫作用.癫痫大鼠经BMK蝎毒处置后,腹侧海马门区PDYN mRNA 阳性神经元数目明显增加,表明蝎毒能翻转腹侧海马门区PDYN mRNA 的表达水平, 选择性地增强海马门区DYN 能抑制性中间神经元的功能.这很可能是其抗癫痫反复发作的重要细胞分子机制之一.

④全蝎初提液还可以抑制脑啡肽原(PENK)mRNA 表达增加,从而可明显降低海马神经元兴奋性及抗癫痫发作敏感性形成.⑤蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heresistant protein,SVHRP) 可诱导培养海马神经元NPY 阳性反应和NPYmRNA 的表达.同时还发现SVHRP 对KA 诱导的原代海马神经元的兴奋毒性损伤具有明显的保护作用, 可能与SVHRP 促进NPY 合成有关.

3.2 对离子通道的调节蝎毒耐热蛋白(SVHRP)能抑制急性分离海马神经元电压依赖性钠电流,改变钠通道的动力学特性,抑制其激活,促进其失活,从而降低神经元兴奋性.BmKIM 可以提高钠电流的阈值, 通过阻断钠通道而使谷氨酸的释放减少来对癫痫起抑制作用.蝎毒中的一系列短链肽能特异性地阻断电压门控的钙离子激活的钾电流,而钾离子延迟电流的阻断势必会降低神经元的兴奋性, 从而减轻痫样发作.

3.3 抑制胶质细胞增生蝎毒可以防止癫痫大鼠星形胶质细胞增生,并可以抑制癫痫后星形胶质瘢痕的形成.进一步研究发现蝎毒抑制神经胶质细胞增生的机制主要是通过下调GFAP 基因表达的转录因子,从而抑制GFAP 的表达,防止胶质化的形成,是其抗癫痫反复发作的重要机制.

3.4 抑制细胞凋亡SV 可以提高KA 癫痫大鼠前深梨状皮质T 区Bcl-2 蛋白的表达.全蝎初提液可以使KA 癫痫模型大鼠DGCs、CA1、CA2、CA3 椎体细胞核内c-Fos 表达明显减少,全蝎还对caspase-8 具有一定的抑制作用,同时也使生理性的抗癫痫机制增强.如今蝎毒在临床上抗癫痫的应用有很大进展.鉴于蝎毒(scorpion venom,SV)成分复杂,毒性很强,人们发明了获取无毒蝎毒的方法:①采集蝎毒(SV);②加蒸馏水后,分离,取上清液;③加热上清液(加热温度为100℃,时间至少为2.5h,方式为煮沸), 即将盛装上清液的容器置于沸水中, 武火煮沸,制得无毒SV 水提液;④将上述无毒SV 水提液与药物辅料制成片剂或胶囊.本发明提供了一种获取安全且具有新的医疗用途的蝎毒制剂的工艺,该制剂对包括癫痫在内的各种兴奋性神经毒引起的脑损伤均有治疗作用.此外,研究还表明SV 中存在着具有抗癫痫活性并且毒性较低的蛋白组分-蝎毒耐热多肽(scorpion venom heat resistant peptide,SVHRP).与SV 粗毒相比,SVHRP 毒性极低,而抗癫痫活性

相对更强,且作用机制明确,非常适合药物开发.人们进而对蝎毒抗癫痫多肽(AEP)与已知的临床常用抗癫痫药在作用方式及特点上的异同进行了比较.首先用头孢霉素Ⅱ,马桑内酯, 印防已毒素和青霉素分别造成清醒大鼠实验性癫痫发作,得到四种癫痫模型.然后对每种模型大鼠均随机分组,分别给予AEP、苯妥英钠、卡马西平等药物.实验表明:AEP 对上述4 种模型癫痫发作有明显的抑制作用,在不同的模型上表现了不同的方式及性质.与苯妥英钠、卡马西平和抗癫痫灵相比:AEP 作用强,用量小,毒性低;在印防已毒素模型上作用与苯妥英钠相似,在青霉素模型上作用与抗痫灵相似.癫痫病是很常见的疾病, 人群发病率约为0.5%~0.6%.作为一种神经系统的慢性疾病,该病的治疗比较复杂.癫痫对患者的大脑造成损害,长期的癫痫病程可引起患者性格改变,出现怪异的行为,影响患者寿命,个别癫痫发作还可能危及生命.这些对于患者和其家人带来的负担是巨大的和长期的.蝎毒在对抗癫痫发作和其反复性方面具有非常显著的效果,如今蝎毒抗癫痫的研究日趋成熟,因此,临床运用蝎毒来治疗癫痫可得到广泛应用.